丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量試劑盒說明書 |
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丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量試劑盒說明書 可見分光光度法 正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定 測定意義： 氧自由基作用于脂質的不飽和脂肪酸，生成過氧化脂質；后者逐漸分解為一系列復雜的化合物，其中包括 MDA。通過檢測 MDA 的水平即可檢測脂質氧化的水平。 測定原理： MDA 與硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)縮合，生成紅色產物，在 532nm有大吸收峰，進行比色后可估測樣品中過氧化脂質的含量；同時測定 600nm 下的吸光度，利用 532nm與 600nm 下的吸光度的差值計算 MDA 的含量。 需自備的儀器和用品： 可見分光光度、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。 試劑的組成和配置： 提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存； 試劑一：液體 30mL×1 瓶，4℃保存； 注意事項： 臨用前注意試劑一是否*溶解，如未溶解，可以 70℃加熱，并振蕩以促進溶解。 MDA 提?。?/span> 1、細菌、細胞或組織樣品的制備： 細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 2、血清（漿）樣品：直接檢測。 測定步驟： 1、吸取 0.6mL試劑一于1.5mL 離心管中，再加入0.2mL 樣本, 混勻。 2、95℃水浴中保溫 30min（蓋緊，防止水分散失），置于冰浴中冷卻，10000g，25℃，離心 10min。 3、吸取上清液于1mL玻璃比色皿中，測定532nm和600nm處的吸光度，記為A532 和A600， ΔA= A532-A600。（蒸餾水調零）
MDA 含量計算： 1、血清（漿）中 MDA 含量的計算： MDA 含量(nmol/mL)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷V 樣=25.8×ΔA 2、細菌、細胞或動物組織中 MDA 含量計算 （1）按照蛋白濃度計算 MDA 含量(nmol/mg prot)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V樣)=25.8×ΔA ÷Cpr 需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質含量測定試劑盒。 （2）按照樣品質量計算 MDA 含量(nmol/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) =25.8×ΔA ÷W (3) 按照細菌或細胞密度計算： MDA 含量(nmol/104 )=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) =0.0516×ΔA V 反總：反應體系總體積，8×10-4 L；ε：丙二醛摩爾消光系數，155×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.2 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500 萬。
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