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總抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

研究意義：

測(cè)定對(duì)象中各種抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等構(gòu)成總抗氧化水平。在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和藥學(xué)研究中常常檢測(cè)血漿、血清、唾液、尿液等各種體液，細(xì)胞或組織等裂解液、植物或中草藥抽提液及各種抗氧化物(antioxidant)溶液的總抗氧化能力。

測(cè)定原理：

在酸性環(huán)境下，還原 Fe³⁺-三吡啶三吖嗪(Fe³⁺-TPTZ)產(chǎn)生藍(lán)色的 Fe²⁺-TPTZ 的能力反映了總抗氧化能力。

自備實(shí)驗(yàn)用品：

恒溫水浴鍋、低溫離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體 100mL×1 瓶，使用前預(yù)冷。

試劑一：液體 15mL×1 瓶，避光保存。

試劑二：液體 1.5mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑三：液體 1.5mL×1 瓶，避光保存。

混合液(現(xiàn)配現(xiàn)用)：將試劑一、試劑二、試劑三按10:1:1的比例混合，使用前37℃預(yù)溫。

樣品的制備：

(1) 血清、血漿、唾液或尿液等液體樣品

血漿（制備時(shí)可以使用肝素或檸檬酸鈉抗凝，不宜使用EDTA抗凝）4℃，5000rpm 離心10min，取上清待測(cè)。血清、唾液或尿液樣品直接用于測(cè)定，也可以-80℃凍存（不宜超30d）后再測(cè)定。

(2) 組織樣品

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

(3) 細(xì)胞樣品

按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎（功率200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；10000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

操作步驟：

1、分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至593nm，蒸餾水調(diào)零。

2、操作表

注意：空白管只需測(cè)定一次。

總抗氧化能力計(jì)算公式：

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.6308x+0.1291，R²=0.9989

（1）按樣本質(zhì)量計(jì)算

總抗氧化能力（U/g）=（△A-0.1291）÷ 0.6308×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)

=53.9×（△A-0.1291）÷W

（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算

總抗氧化能力（U/mg prot）=（△A-0.1291）÷0.6308×V 反總÷(V 樣×Cpr)

=53.9×（△A-0.1291）÷Cpr

（3）按細(xì)胞計(jì)算

總抗氧化能力（U/10⁴cell）=（△A-0.1291）÷0.6308×V反總÷V樣×V樣總÷細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）= 53.9×（△A-0.1291）÷ 細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）

（4）按液體體積計(jì)算

總抗氧化能力（U/mL）=（△A-0.1291）÷0.6308×V 反總÷V 樣= 53.9×（△A-0.1291）

V 樣總：加入提取液體積，1 mL； V 反總：反應(yīng)總體積，204μL；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，

6μL；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL

b.用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.3154x+0.1291；R²=0.9989

（1）按樣本質(zhì)量計(jì)算

總抗氧化能力（U/g）=（△A-0.1291）÷0.3154×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)

=107.8×（△A-0.1291）÷W

（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算

總抗氧化能力（U/mg prot）=（△A-0.1291）÷0.3154×V 反總÷(V 樣×Cpr)

=107.8×（△A-0.1291）÷Cpr

(3) 按細(xì)胞計(jì)算

總抗氧化能力（U/10⁴cell）=（△A-0.1291）÷0.3154×V反總÷V樣×V樣總÷細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）= 107.8×（△A-0.1291）÷ 細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）

（4）按液體體積計(jì)算

總抗氧化能力（U/mL）=（△A-0.1291）÷0.3154×V 反總÷V 樣= 107.8×（△A-0.1291）

V 樣總：加入提取液體積，1 mL； V 反總：反應(yīng)總體積，204μL；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，

6μL；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL

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