β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase, β-GC）試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

β-GC（EC 3.2.1.21）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化β-糖苷鍵水解， 具有多方面生理作用：在纖維素的糖化作用中，β-GC 負(fù)責(zé)進(jìn)一步水解纖維素二糖和纖維素寡糖生成葡萄糖；β-GC 水解萜烯類(lèi)香氣前驅(qū)體，使糖苷鍵合態(tài)變成游離態(tài)。從而產(chǎn)生香味；

β-GC 能夠水解植物體內(nèi)野黑櫻苷，釋放 HCN，從而防止昆蟲(chóng)取食。

測(cè)定原理：

β-GC 分解對(duì)-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷生成對(duì)-硝基苯酚，后者在 400nm 有大吸收峰， 通過(guò)測(cè)定吸光值升高速率來(lái)計(jì)算β-GC 活性。

自備用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水

試劑組成和配制：

提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入 12mL 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存。

試劑二：液體 15mL×1 瓶，4℃保存。試劑三：液體 15mL×1 瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；15000g

4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 400nm，蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表

充分混勻，室溫靜置 2min 后，400nm 處測(cè)定吸光值 A，計(jì)算 ΔA=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

β-GC 活力計(jì)算：

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為 y=0.32x-0.0027；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL），y 為吸光值。

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每小時(shí)產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

β-GC 活力(nmol/h/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.32×V 反總]÷(V 樣×Cpr)÷T

=62.5×(ΔA+0.0027)÷Cpr

需要另外測(cè)定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織每小時(shí)產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

β-GC 活力(nmol/h/g 鮮重)＝[(ΔA+0.0027)÷0.32×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=62.5×(ΔA+0.0027) ÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每小時(shí)產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

β-GC 活力(nmol/h/104cell)=[(ΔA+0.0027) ÷0.32×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.125×(ΔA +0.0027)

Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.3mL；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.03mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，

500 萬(wàn)；T：反應(yīng)時(shí)間，0.5h。

b.用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為 y=0.16x-0.0027；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL），y 為吸光值。

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每小時(shí)產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

β-GC 活力(nmol/h/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.16×V 反總]÷(V 樣×Cpr)÷T

=125×(ΔA+0.0027)÷Cpr

需要另外測(cè)定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織每小時(shí)產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

β-GC 活力(nmol/h/g 鮮重)＝[(ΔA+0.0027)÷0.16×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=125×(ΔA+0.0027) ÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每小時(shí)產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

β-GC 活力(nmol/h/104cell)=[(ΔA+0.0027) ÷0.16×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.25×(ΔA +0.0027)

Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.3mL；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.03mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，

500 萬(wàn)；T：反應(yīng)時(shí)間，0.5h。

Ca++ Mg++-ATP酶活性測(cè)定說(shuō)明書(shū)